اسپکتروفتومتر ابزاری است که میزان فوتون (شدت نور) جذب شده را پس از عبور از محلول نمونه اندازه گیری می کند. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر ، می توان با اندازه گیری شدت نور شناسایی شده ، مقدار ماده شیمیایی شناخته شده (غلظت) را نیز تعیین کرد.

انواع اسپکتروفتومتر از نظر ساختمانی

تک پرترویی ، دوپرتویی ، دوپرتوی مکانی ، دو پرتویی زمانی

اجزای اسپکتروفتومتر

منبع تابش 

نقش منبع نور اسپکتروفتومتر تولید انرژی تابشی است. منبع نور بسته به منطقه مورد استفاده در دستگاه اسپکتروفتومتر متفاوت است. لامپهای تنگستن به طور مداوم طول موجهای زیادی را ساطع می کنند ، که برای اندازه گیری در منطقه مرئی و اشعه ماورا بنفش از 350 تا 1100 نانومتر استفاده می شود.

از آنجا که پوشش شیشه ای رشته ای در طول موج های کمتر از 350 نانومتر شروع به جذب می کند ، استفاده از لامپ های تنگستن برای اندازه گیری طول موج های فرابنفش (190 تا 350 نانومتر) توصیه نمی شود. یک لامپ دوتریوم در یک اسپکتروفتومتر یک طیف مداوم در منطقه UV ایجاد می کند (190 تا 350 نانومتر). بنابراین ، برای اندازه گیری طول موج های منطقه ماور بنفش استفاده می شود.

عملکرد لامپها در دستگاه اسپکتروفتومتر بدین صورت است که وقتی میزان جذب در طیف UV اندازه گیری می شود ، لامپ دیگر خاموش می شود و هنگامی که میزان جذب در نور مرئی اندازه گیری می شود ، عکس این اتفاق می افتد ، به همین دلیل. از تداخل در طول موج های غیرضروری در نور ساطع شده از نمونه خودداری کنید.

محفظه نمونه (Cell)

این قسمت برای ذخیره نمونه آزمایش شده است ، مدلهای مختلف در اشکال و اندازه های مختلف برای انواع مختلف دستگاه اسپکتروفتومتر موجود است که به آنها پوشش ، میکرو سلول ، میکروپلیت ، لوله آزمایش و … می گویند.

در اسپکتروفتومترهای قابل مشاهده UV ، محفظه نگهدارنده نمونه یک مکعب مستطیل شکل است. کووت نباید نور رادیواکتیو را جذب کند. پوششهای شیشه ای در طول موجهای قابل مشاهده در محدوده 340 نانومتر تا 1000 نانومتر استفاده می شوند و انواع دیگر پوششهای ساخته شده از سیلیس یا کوارتز و دارای بافت سیلیکون می توانند در محدوده نور مرئی از 220 نانومتر تا 340 نانومتر و برای منطقه ماوراlet بنفش و برنامه های کاربردی. همچنین قطر کووت به دستگاه بستگی دارد اما معمولاً 1 سانتی متر است. کتهای پلاستیکی ارزان قیمتی نیز وجود دارند که بیشتر در زمینه دید استفاده می شوند.

مونوکروماتور یا تک رنگ ساز

نقش تک رنگ در اسپکتروفتومتر ، جدا کردن طول موج مورد نیاز ، حذف امواج ناخواسته و ایجاد نور تک رنگ است. مونوکروماتیک به گروهی از اجزای تبدیل کننده نور سفید به امواجی با طول موج های مختلف گفته می شود که برای خواندن غلظت نمونه از هر طول موج استفاده می شود.

اجزای تک رنگ شامل: شکافی است که نور تولید شده توسط منبع نور را تا حد معینی محدود می کند ، مجموعه ای از آینه ها برای عبور نور از سیستم نوری ، یک قطعه برای جدا کردن طول موج های نور که ممکن است منشوری ، شبکه انکساری یا توری باشد (منشورها) که اکنون زیاد مورد استفاده قرار نمی گیرد و در حال استفاده است. بیشتر شبکه انکساری). از فیلترها برای انتقال تابش در یک فرکانس خاص و از بین بردن فرکانس های دیگر نیز استفاده می شود و در نهایت برای تعیین طول موج از نمونه از خروجی استفاده می شود.
روش کار منشور در دستگاه اسپکتروفتومتر از طریق تفاوت در ضریب شکست مواد مختلف است که نور را با توجه به طول موج های ترکیب آن مشخص می کند.
توری شکست اثر برش بخشهایی از طول موج است. از شبکه پراش می توان هم برای انتقال و هم جهت برگشت تابش استفاده کرد ، اما مقدار و روش پراکندگی طول موج های برخورد کننده به شکل و هندسه شبکه بستگی دارد.
گریتینگ ساده ترین و ارزان ترین نوع چراغ های انباشته است. فیلترها به گونه ای کار می کنند که تمام طول موج ها جذب شده و یک طول موج از آنها عبور می کند و این طول موج خیلی باریک نیست ، یعنی از طیف وسیعی از طول موج ها عبور می کند. این فیلتر برای کاربردهای خاص یا موارد و مواد ویژه ای استفاده می شود که هزینه کمتری نیز برای کاربر دارد.

آشکارساز 

برای اندازه گیری شدت امواج استقاده می شود و دارای خواص فتوالکتریک بوده که انرژی نورانی را به الکتریکی تبدیل می کنند.

به طور کلی یک اسپکتروفتومتر از دو دستگاه تشکیل شده است. یک طیف سنج و یک نور سنج. طیف سنج دستگاهی است که به طور معمول نور را پراکنده و اندازه گیری می کند. یک فتومتر آشکارساز فوتوالکتریک را نشان می دهد که شدت نور را اندازه گیری می کند.

فتوولتایی

در این آشکارساز تابش فتون به سطح نیمه هادی باعث خروج الکترون ها شده و الکترون های جدا شده توسط یک الکترود نقره جمع شده و پتانسیل تولید می نماید.

فتولوله 

در لوله های نوری ، جریان الکترون در اثر برخورد فوتون ها ایجاد می شود. این یک لوله خلاuum است که دارای یک فوتو کاتد پوشش داده شده با Cs است. فوتون های پرانرژی به الکترود منفی برخورد می کنند و باعث می شوند الکترون ها ساطع شوند ، سپس الکترون ها به سمت آند رانده می شوند و جریان الکتریکی ایجاد می کنند.

فتومالتی پلایر یا چند لایه ساز نوری

این سیستم دارای پایه PV یکسانی است ، اما حاوی کاتدها و آندهای زیادی است ، هر الکترود مربوط به الکترود قبلی است ، اما کاتد نسبت به الکترود بعدی است. در این حالت ، یک سری الکترون بوسیله یک میدان الکتریکی ایجاد و تسریع می شود. جریان تولید شده بارها تقویت می شود تا بتواند انرژی بسیار کم فوتون را تشخیص و ثبت کند. حساسیت آنها به لوله های نوری چندین برابر می شود. با استفاده از این ردیاب ، جذب می تواند دقیقاً به 6 رقم اعشار برسد.

صفحه نمایشگر

اسپکتروفتومترها می توانند خروجی خود را به روش های مختلف نمایش دهند. اما معمولاً اتصال آن به رایانه و استفاده از نرم افزار برای تجزیه و تحلیل داده ها و نمایش آن به عنوان نمودار میزان ترافیک یا جذب بر حسب طول موج ، معمول است.

انواع اسپکتروفتومتر بسته به دامنه طول موج منبع نور

• طیف سنج اشعه ماورا بنفش : از نور بیش از محدوده فرابنفش (185 – 400 نانومتر) و دامنه مرئی (400 – 700 نانومتر) از طیف تابش الکترومغناطیسی استفاده می کند.

• اسپکتروفتومتر IR : از نور در محدوده مادون قرمز (700 – 15000 نانومتر) از طیف تابش الکترومغناطیسی استفاده می کند.

در اسپکتروفتومتری قابل مشاهده ، میزان جذب یا انتقال ماده خاصی را می توان با رنگ مشاهده شده تعیین کرد. به عنوان مثال ، یک نمونه محلول که نور را در تمام دامنه های مرئی جذب می کند (یعنی هیچ یک از طول موج های مرئی را منتقل نمی کند) در تئوری سیاه به نظر می رسد. 

از طرف دیگر ، اگر تمام طول موج های مرئی منتقل شود (یعنی چیزی را جذب نكند) ، نمونه محلول سفید به نظر می رسد. اگر یک نمونه محلول نور قرمز را جذب کند (~ 700 نانومتر) ، سبز به نظر می رسد زیرا سبز رنگ مکمل قرمز است. اسپکتروفتومترهای قابل مشاهده ، در عمل ، از منشور برای محدود کردن محدوده مشخصی از طول موج (برای فیلتر کردن طول موج های دیگر) استفاده می کنند تا پرتوی خاص نور از طریق یک نمونه محلول عبور کند.

ساختار اساسی اسپکتروفتومترها

شکل زیر ساختار اساسی اسپکتروفتومترها را نشان می دهد. از یک منبع نور ، یک کولیماتور ، یک رنگ ساز ، یک انتخابگر طول موج ، یک کووت برای محلول نمونه ، یک آشکارساز فوتوالکتریک و یک نمایشگر دیجیتال یا یک متر تشکیل شده است. سازوکار دقیق در زیر شرح داده شده است. شکل بعد  یک نمونه اسپکتروفتومتر را نشان می دهد (مدل: Spectronic 20D).

• طیف سنج : طیف مطلوبی از طول موج نور را تولید می کند. ابتدا یک کولیماتور (لنز) یک پرتوی مستقیم نور (فوتون ها) را منتقل می کند که از یک تک رنگ (منشور) عبور می کند و آن را به چندین طول موج جز component (طیف) تقسیم می کند. سپس یک انتخابگر طول موج (شکاف) فقط طول موج های مورد نظر را انتقال می دهد ، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است.

• نورسنج : پس از عبور طول موج دلخواه نور از محلول نمونه در کووت ، فوتومتر مقدار فوتونهای جذب شده را تشخیص داده و سپس سیگنالی را به گالوانومتر یا نمایشگر دیجیتال ارسال می کند ، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است.

شما برای تولید انواع طول موج به یک طیف سنج نیاز دارید زیرا ترکیبات مختلف در طول موج های مختلف بهترین جذب را دارند. به عنوان مثال ، p-nitrophenol (فرم اسیدی) حداکثر جذب را در حدود 320 nm دارد و p-nitrophenolate (شکل اساسی) بهترین جذب را در 400nm دارد ، همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است.

با نگاهی به گرافی که میزان جذب و طول موج را اندازه گیری می کند ، یک نقطه ایزوبستاتیک نیز مشاهده می شود. 

نقطه isosbestic طول موج است که در آن جذب دو یا چند گونه یکسان هستند است. ظهور یک نقطه ایزوبستاتیک در یک واکنش نشان می دهد که برای تشکیل یک محصول از یک واکنش دهنده مورد نیاز نیست. شکل 4 نمونه ای از یک نقطه ایزوبستاتیک را نشان می دهد.

با مراجعه به شکل 1 (و شکل 5) ، مقدار فوتونی که از داخل کووت عبور می کند و به آشکارساز می رود ، به طول کووت و غلظت نمونه بستگی دارد. هنگامی که از شدت نور پس از عبور از داخل کووت مطلع شدید ، می توانید آن را به انتقال (T) مرتبط کنید. انتقال ، کسری از نور است که از طریق نمونه عبور می کند. این را می توان با استفاده از معادله محاسبه کرد:

جایی که I _t است شدت نور پس از عبور پرتوی نور از کووت و I _o شدت نور قبل از عبور پرتوی نور از کووت است. انتقال به جذب توسط عبارت مربوط می شود:

جایی که جذب به معنای مقدار فوتونی است که جذب می شود. با مقدار جذب شناخته شده از معادله فوق ، می توانید غلظت ناشناخته نمونه را با استفاده از قانون Beer-Lambert تعیین کنید. شکل 5 انتقال نور از طریق یک نمونه را نشان می دهد. طول l برای قانون Lambert 

قانون Beer-Lambert

قانون Beer-Lambert (همچنین به عنوان قانون Beer شناخته می شود) بیان می کند که بین جذب و غلظت نمونه رابطه خطی وجود دارد. به همین دلیل ، قانون Beer فقط در صورت وجود رابطه خطی می تواند اعمال شود.  چنین نوشته شده است:

A = ϵ l c

جایی که

• A اندازه گیری میزان جذب (بدون واحد) است ،
• ϵ ضریب انقراض مولی یا جذب مولار (یا ضریب جذب) است ،
• l طول مسیر است ، و
• c غلظت است.
• ضریب انقراض مولی به صورت ثابت داده می شود و برای هر مولکول متفاوت است. از آنجا که جذب هیچ واحدی را حمل نمی کند ، واحد برای ϵ باید واحد طول و غلظت را لغو کند. در نتیجه، ϵ

  “>εεواحد دارد: L · mol ^– 1 · cm ^– 1 . طول مسیر به سانتی متر اندازه گیری می شود. از آنجا که یک طیف سنج استاندارد از یک کووت استفاده می کند که عرض آن 1 سانتی متر است ،l همیشه برابر 1 سانتی متر فرض می شود. از زمان جذب ،ϵ، و طول مسیر مشخص است ، ما می توانیم غلظت را محاسبه کنیم c از نمونه

کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر

غلظت مواد را تعیین کرده و فعالیت اکثر آنزیم ها ، تری گلیسیریدها ، کلسترول ، لیپوپروتئین ها ، قند ، کراتینین و اوره را اندازه گیری کنید. 

طیف گسترده ای از تجزیه و تحلیل ها را می توان با کاربردهای بالینی و تحقیق اندازه گیری کرد ، طیف گسترده ای از داروها و طیف گسترده ای از متابولیت ها را می توان با اسپکتروفتومتری اندازه گیری کرد.

ساختار مولکولی را مطالعه کنید ، ترکیبات را شناسایی کنید ، ساختارها را مقایسه کنید و میزان جذب و حداکثر طول موج را پیدا کنید. . این دستگاه  یکی از پرکاربردترین دستگاه کیفی طیف سنجی در موضوعات تحقیقاتی است.

موارد قابل اندازه گیری دستگاه اسپکتروفتومتر

جامدات و مایعات که واحد اندازه گیری ppm و دقت اندازه گیری دستگاه ١-١٠ppm بسته به ماهیت نمونه