الکتروفورز چیست؟

دستگاه الکتروفورز یکی از تجهیزات آزمایشگاهی است که معمولاً در آزمایشگاه برای جداسازی مولکول های باردار مانند DNA بر اساس اندازه استفاده می شود.

• مولکول های باردار از طریق یک ژل حرکت می کنند که جریان الکتریکی از آن عبور کند.
• جریان الکتریکی در سراسر ژل اعمال می شود به طوری که یک سر ژل دارای بار مثبت و انتهای دیگر دارای بار منفی است.
• حرکت مولکول های باردار را مهاجرت می گویند. مولکول ها به سمت بار مخالف حرکت می کنند. بنابراین یک مولکول با بار منفی به سمت انتهای مثبت کشیده می شود (مخالف ها جذب می شوند!).
• این ژل از یک ماتریس نفوذپذیر تشکیل شده است که کمی شبیه به غربال است که وقتی جریان الکتریکی از آن عبور می کند، مولکول ها می توانند از آن عبور کنند.
• مولکول‌های کوچک‌تر سریع‌تر از ژل مهاجرت می‌کنند و بنابراین بیشتر از قطعات بزرگ‌تر حرکت می‌کنند که آهسته‌تر مهاجرت می‌کنند و بنابراین مسافت کوتاه‌تری را طی می‌کنند. در نتیجه مولکول ها بر اساس اندازه از هم جدا می شوند.
•  

تکنیک ژل الکتروفورز

الکتروفورز یک تکنیک بسیار پرکاربرد است که اساساً جریان الکتریکی را به مولکول‌های بیولوژیکی اعمال می‌کند، خواه آنها معمولاً DNA باشند، می‌توانند پروتئین یا RNA نیز باشند.و این قطعات را به قطعات بزرگ‌تر یا کوچک‌تر جدا می‌کند.

در کاربردهای مختلفی استفاده می شود. همه چیز، از پزشکی قانونی برای تعیین هویت افرادی که ممکن است در یک جنایت دخیل بوده باشند، با پیوند دادن الگوی DNA آنها، الگوی الکتروفورز آنها، به نمونه ای که در یک پایگاه داده است.

کل مبنایی که ژنوم انسان بر اساس آن ساخته شد با چیزی به نام الکتروفورز مویرگی است که DNA را به قطعات کوتاه‌تر جدا می‌کند و سپس آنها را روی این ژل‌های الکتروفورز اجرا می‌کند که اجازه می‌دهد الگوهای As، Cs، Ts و Gs روشن شوند.

آنها همچنین در تحقیقات پروتئین و سپس تحقیقات جهش ژنتیکی بسیار مهم هستند. 

از آنجایی که وقتی پروتئین ها یا DNA جهش می یابند، اغلب طولانی تر یا کوتاه تر می شوند، و بنابراین در ژل الکتروفورز متفاوت از حالت عادی ظاهر می شوند، بنابراین بسیاری از آزمایش های تشخیصی هنوز با استفاده از الکتروفورز انجام می شود، بنابراین این یک روش تحقیقاتی بسیار پرکاربرد است.

برای درک عملکرد ژن و پروتئین مهم است، اما اکنون به حوزه تشخیص بالینی و پزشکی قانونی نیز وارد شده است. الکتروفورز معمولاً در جعبه ای انجام می شود که یک طرف آن دارای بار مثبت و در طرف دیگر بار منفی است.

و همانطور که همه ما در فیزیک پایه یاد گرفتیم، وقتی یک مولکول باردار را در محیطی مانند آن قرار می دهید، مولکول های منفی به سمت بار مثبت می روند و بالعکس. 

در نگاه کردن به پروتئین‌های موجود در ژل، در یکی از این جعبه‌ها، معمولاً کل پروتئین را می‌گیرید و دوباره به کل طول پروتئین نگاه کنید و ببینید چقدر بزرگ است، و هر چه بزرگتر باشد، کوتاهتر به ژل مهاجرت می کند، به طوری که پروتئین های کوچک در انتهای ژل قرار می گیرند، زیرا آنها مهاجرت کرده اند.

دورترین ها و بزرگ ترین ها در اوج باقی می مانند. در مورد DNA، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل را از یک سلول روی یک ژل اجرا کنید.

آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند.

خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

کوتاه‌تر به داخل ژل مهاجرت می‌کند، به طوری که پروتئین‌های کوچک در انتهای ژل قرار می‌گیرند، زیرا آنها در دورترین فاصله‌ها مهاجرت کرده‌اند و بزرگ‌ترین‌ها در بالا باقی می‌مانند.

در مورد DNA، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل را از یک سلول روی یک ژل اجرا کنید.

 آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

کوتاه‌تر به داخل ژل مهاجرت می‌کند، به طوری که پروتئین‌های کوچک در انتهای ژل قرار می‌گیرند، زیرا آنها در دورترین فاصله‌ها مهاجرت کرده‌اند و بزرگ‌ترین‌ها در بالا باقی می‌مانند.

در مورد DNA، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل را از یک سلول روی یک ژل اجرا کنید.

آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

زیرا آنها به دورترین ها مهاجرت کرده اند و بزرگ ترین ها در اوج خواهند ماند. در مورد DNA، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل را از یک سلول روی یک ژل اجرا کنید.

آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است.

که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

زیرا آنها به دورترین ها مهاجرت کرده اند و بزرگ ترین ها در اوج خواهند ماند. در مورد DNA، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل را از یک سلول روی یک ژل اجرا کنید.

آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

یک مولکول DNA کامل از یک سلول به یک ژل. آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

یک مولکول DNA کامل از یک سلول به یک ژل. آنقدر بزرگ است که هرگز وارد ژل نمی‌شود، بنابراین کاری که دانشمندان انجام می‌دهند، و کاری که امروزه مردم در کلاس‌های درس انجام می‌دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از چیزهایی مانند آنزیم‌های کتیبه‌ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل‌تری در یک راه قابل تکرار و سپس آن قطعات، بسته به اینکه قطعات چقدر بزرگ هستند، کم و بیش به داخل ژل پدر به پایین جعبه از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

انواع الکتروفورز

الکتروفورز معمولی

الکتروفورز معمولی سنتی و پرکاربردترین روش آزمایشگاهی بالینی برای جداسازی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک است. این تکنیک معمولاً بر روی یک ژل دال مستطیلی شکل انجام می شود و به آن “الکتروفورز ناحیه” نیز می گویند زیرا می تواند چندین نمونه و کنترل را روی یک ژل قرار دهد و می تواند برای جداسازی املاح در یک اجرا استفاده شود. همچنین می توان از آن در جداسازی پروتئین های CSF و ادرار، ایزوآنزیم ها، لیپوپروتئین ها و هموگلوبین استفاده کرد.

الکتروفورز با وضوح بالا

الکتروفورز با وضوح بالا (HRE) چیزی نیست جز الکتروفورز معمولی با استفاده از ولتاژ بالا. اگر به وضوح پروتئین بالاتری نیاز دارید (به عنوان مثال جداسازی پروتئین‌های CSF برای تشخیص مولتیپل اسکلروزیس، جداسازی زنجیره‌های سبک در ادرار برای تشخیص زودهنگام مولتیپل میلوما و غیره) معمولاً به شدت توصیه می‌شود.

 از آنجایی که افزایش ولتاژ باعث افزایش گرمای تولیدی نیز می شود، HRE شامل یک ابزار خنک کننده برای جلوگیری از دناتوره شدن پروتئین ها و خشک شدن ژل و سایر اجزا است.  

پلی آکریل آمید (PAGE)

الکتروفورز توسط آکریل آمید (همچنین به عنوان PAGE شناخته می شود) معمولاً برای جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه مولکولی و نسبت بار به جرم استفاده می شود.

 با کمک صفحات عمودی یا ژل گنجانده شده در میله ها یا استوانه های عمودی، محققان می توانند DNA 100 جفت باز یا کمتر را جدا کرده و پروتئین های فردی را در یک سرم (مانند انواع ژنتیکی، ایزوآنزیم ها) تجزیه و تحلیل کنند.

 جدای از سادگی و سرعت جداسازی آن، محققان PAGE را دوست دارند زیرا ژل ها در محدوده وسیعی از pH و دما پایدار هستند و ژل هایی با اندازه منافذ مختلف می توانند تشکیل شوند.

الکتروفورز مویرگی (CE)

الکتروفورز مویرگی در مویرگ‌های قطر زیر میلی‌متری (یعنی لوله‌های مویین سیلیسی بسیار نازک و ذوب شده با قطر داخلی 25 تا 100 میلی‌متر) انجام می‌شود و الکتروفورز و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا را برای تسهیل جداسازی آنالیت ترکیب می‌کند.

 تعداد زیادی از محققان استفاده از CE را ترجیح می دهند زیرا فقط به مقدار کمی از نمونه نیاز دارد، بسیار کارآمد است، نتایج سریع تولید می کند و می تواند به راحتی خودکار شود. 

فوکوس ایزوالکتریک (IEF)

اگر می خواهید ترکیبات آمفوتریک (مثلا پروتئین ها) را با وضوح بالاتر جدا کنید، باید از این پروتکل استفاده کنید. IEF از ژل های تزریق شده شیمیایی برای ایجاد گرادیان pH در سطح ژل استفاده می کند و ولتاژ بسیار بالایی را برای تسهیل مهاجرت مولکول های پروتئین تا نقطه ای که بار خالص آنها صفر است (نقطه ایزوالکتریک) اعمال می کند.

 برخی از مزایای استفاده از IEF عبارتند از: سهولت کار (یعنی قرار دادن کاربرد نمونه مهم نیست زیرا پروتئین همیشه در موقعیتی مطابق با pl خود قرار می گیرد) و وضوح بالای آن. 

الکتروفورز ایمونوفیکساسیون (IFE)

به طور کلی، IFE در تشخیص گاموپاتی های ایمونوگلوبولین مونوکلونال یا انبساط مونوکلونال یک آنتی بادی منفرد و غیرعملکردی مانند IgA، IgG و IgM استفاده می شود که وجود آن ممکن است نشان دهنده شرایطی مانند مولتیپل میلوما یا ماکروگلوبولینمی والدنستروم باشد.

 همچنین می توان از آن در مطالعه آنتی ژن های پروتئینی و محصولات تقسیم شده آنها استفاده کرد.

الکتروفورز ژل میدان پالسی (PFGE)

شما نمی‌توانید مولکول‌های بزرگ DNA بیش از 50 کیلو باز (کیلوباز) را با استفاده از AGE یا PAGE در سیستم‌های الکتروفورز معمولی جدا کنید، زیرا اندازه منافذ ژل به سادگی بسیار کوچک است که امکان مهاجرت آنها را فراهم نمی‌کند.

 با این حال، می‌توانید از الکتروفورز ژل میدان پالسی (PFGE) برای تسهیل تقسیم موفقیت‌آمیز مولکول‌های DNA بزرگ (تا 10 مگابایت) استفاده کنید. 

PFGE به طور موثری قطعات DNA را با اعمال یک جریان الکتریکی که به طور مداوم تغییر جهت می دهد روی ماتریس ژل جدا می کند.

 با تعویض الکترودهای مثبت و منفی در چرخه ها در طول الکتروفورز، مولکول های DNA مجبور به تغییر جهت خود می شوند و در نهایت به قطعات کوچکتر تجزیه می شوند. 

PFGE معمولاً در ژنوتیپ یا انگشت نگاری ژنتیکی استفاده می شود و به دلیل سادگی و تکرارپذیری به عنوان استاندارد طلایی در زیرگروه بندی باکتری ها در نظر گرفته می شود. 

با این حال، این پروتکل بسیار وقت گیر است و به سطح بالایی از مهارت نیاز دارد. 

بعلاوه، تفسیر نتایج ممکن است دشوار باشد زیرا قطعات بر اساس اندازه آنها جدا می شوند (یعنی جداسازی بر اساس توالی نیست) و قطعات هم اندازه ممکن است از همان قسمت کروموزوم نیایند.

الکتروفورز دو بعدی

در الکتروفورز دو بعدی، نمونه با استفاده از دو تکنیک جداسازی مجزا (به عنوان مثال IEF به دنبال PAGE یا AGE) جدا می‌شود و در دو بعد با زوایای قائم به یکدیگر شناسایی می‌شود.

 از آنجایی که باندهای حاصل با الکتروفورز دوم بیشتر حل می شوند، احتمال زیادی وجود دارد که اطلاعات بیشتری از نمونه خود به دست آورید. 
الکتروفورز دو بعدی بسیار تخصصی است و معمولاً در تحقیقات پروتئومیکس و ژنتیک استفاده می شود.

 در حالی که می تواند هزاران پروتئین را در یک اجرا تجزیه و تحلیل کند، این تکنیک به مقدار قابل توجهی از نمونه اولیه نیاز دارد، تکرارپذیری محدودی دارد و توان عملیاتی پایینی دارد. 

علاوه بر این، این روش تنها با مولکول‌های زیستی با اندازه متوسط ​​تا بزرگ کار می‌کند و اندازه‌گیری دقیقی را ایجاد نمی‌کند.

الکتروفورز ژل و DNA

• الکتروفورز شما را قادر می سازد تا قطعات DNA با طول های مختلف را تشخیص دهید.
• DNA دارای بار منفی است، بنابراین، هنگامی که یک جریان الکتریکی به ژل اعمال می شود، DNA به سمت الکترود با بار مثبت مهاجرت می کند.
• رشته‌های کوتاه‌تر DNA سریع‌تر از رشته‌های بلندتر در ژل حرکت می‌کنند و در نتیجه قطعات به ترتیب اندازه مرتب می‌شوند.
• استفاده از رنگ، فلورسنت  برچسب ها یا رادیواکتیو ^؟ برچسب‌ها DNA روی ژل را قادر می‌سازد پس از جداسازی آن‌ها دیده شود. آنها به صورت نوارهایی روی ژل ظاهر می شوند.
• یک نشانگر DNA با قطعاتی با طول های مشخص معمولاً همزمان با نمونه ها از ژل عبور می کند.
• با مقایسه باندهای نمونه‌های DNA با نوارهای نشانگر DNA، می‌توانید طول تقریبی قطعات DNA در نمونه‌ها را تعیین کنید.

کاربرد الکتروفورز

طرز تهیه ژل

• ژل آگارز  معمولاً برای تجسم قطعات DNA استفاده می شود. غلظت آگاروز مورد استفاده برای ساخت ژل به اندازه قطعات DNA که با آن کار می کنید بستگی دارد.
• هر چه غلظت آگارز بیشتر باشد، ماتریکس متراکم تر است و بالعکس. قطعات کوچکتر DNA در غلظت های بالاتر آگارز جدا می شوند در حالی که مولکول های بزرگتر به غلظت کمتر آگارز نیاز دارند.
• برای ساختن یک ژل، پودر آگارز را با یک بافر الکتروفورز مخلوط کرده و تا دمای بالا حرارت می دهند تا تمام پودر آگارز ذوب شود.
• سپس ژل مذاب در یک سینی ریخته گری ژل ریخته می شود و یک “شانه” در یک انتها قرار می گیرد تا چاه هایی برای نمونه به پیپت شود.
• هنگامی که ژل سرد و جامد شد (اکنون به جای شفاف شدن، مات می شود) شانه برداشته می شود.
• اکنون بسیاری از افراد از ژل های از پیش ساخته شده استفاده می کنند.
• سپس ژل در یک مخزن الکتروفورز قرار می گیرد و بافر الکتروفورز در مخزن ریخته می شود تا سطح ژل پوشانده شود.
•  بافر جریان الکتریکی را هدایت می کند. نوع بافر مورد استفاده به اندازه تقریبی قطعات DNA در نمونه بستگی دارد.

آماده سازی DNA برای الکتروفورز

• قبل از الکتروفورز، یک رنگ به نمونه DNA اضافه می شود تا ویسکوزیته نمونه را افزایش دهد که از شناور شدن آن از چاه ها جلوگیری می کند و به این ترتیب مهاجرت نمونه از طریق ژل قابل مشاهده است.
• یک نشانگر DNA (همچنین به عنوان استاندارد اندازه یا نردبان DNA شناخته می شود) در اولین چاه ژل بارگذاری می شود. قطعات موجود در نشانگر دارای طول مشخصی هستند، بنابراین می توان از آنها برای کمک به تقریبی اندازه قطعات در نمونه ها استفاده کرد.
• سپس نمونه های DNA آماده شده به چاهک های باقی مانده ژل پیپت می شوند.
• هنگامی که این کار انجام شد، درپوش روی مخزن الکتروفورز قرار می‌گیرد و مطمئن می‌شویم که جهت ژل و الکترودهای مثبت و منفی درست است (ما می‌خواهیم DNA از ژل به انتهای مثبت مهاجرت کند).

جدا کردن قطعات

• سپس جریان الکتریکی روشن می شود تا DNA با بار منفی از طریق ژل به سمت مثبت ژل حرکت کند.
• طول‌های کوتاه‌تر DNA سریع‌تر از طول‌های طولانی‌تر حرکت می‌کنند، بنابراین در زمان اجرای جریان بیشتر حرکت کنید.
• فاصله ای که DNA در ژل مهاجرت کرده است را می توان به صورت بصری با نظارت بر مهاجرت رنگ بافر بارگذاری ارزیابی کرد.
• جریان الکتریکی به اندازه کافی روشن باقی می ماند تا اطمینان حاصل شود که قطعات DNA به اندازه کافی در ژل حرکت می کنند تا آنها را جدا کنند، اما نه آنقدر طولانی که از انتهای ژل خارج شوند.

منبع :wiki/Electrophoresis