Elektroforez nedir?

Elektroforez, DNA gibi yüklü molekülleri boyutlarına göre ayırmak için laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir laboratuvar ekipmanıdır .

• Yüklü moleküller, içinden bir elektrik akımının geçtiği bir jel içerisinde hareket eder.
• Jelin bir ucunun pozitif, diğer ucunun negatif yüklü olması için jel boyunca bir elektrik akımı uygulanır.
• Yüklü moleküllerin hareketine göç denir. Moleküller zıt yönlerde hareket eder. Böylece negatif yüklü bir molekül pozitif uca doğru çekilir (zıtlar emilir!).
• Jel, içinden bir elektrik akımı geçtiğinde moleküllerin geçebileceği bir elek gibi olan geçirgen bir matristen yapılmıştır.
• Daha küçük moleküller jellerden daha hızlı hareket eder ve bu nedenle daha yavaş hareket eden ve dolayısıyla daha kısa mesafeler kat eden daha büyük parçalardan daha fazla hareket eder. Sonuç olarak, moleküller büyüklüklerine göre ayrılır.

Jel elektroforez tekniği

Elektroforez, biyolojik moleküllere temel olarak bir elektrik akımı uygulayan, genellikle DNA olsunlar, protein veya RNA da olabilen ve bu parçaları daha büyük veya daha küçük parçalara ayıran çok yönlü bir tekniktir.

Çeşitli uygulamalarda kullanılır. Adli tıptan, DNA kalıplarını, elektroforez kalıplarını bir veri tabanındaki bir örneğe bağlayarak bir suça karışmış olabilecek kişileri belirlemeye kadar her şey.

İnsan genomunun inşa edildiği tüm temel, DNA’yı daha kısa parçalara ayıran ve daha sonra onları bu elektroforez jelleri üzerinde çalıştıran ve As, Cs, Ts ve Gs modellerinin aydınlanmasına izin veren bir kılcal elektroforezdir.

Protein araştırmalarında ve ardından genetik mutasyon araştırmalarında da çok önemlidirler. Proteinler veya DNA mutasyona uğradığında, genellikle daha uzun veya daha kısa hale gelirler ve bu nedenle jel elektroforezinde normalden farklı görünürler.

Genlerin ve proteinlerin işlevini anlamak önemlidir, ancak artık klinik tanı ve adli tıp alanına da girmiştir. Elektroforez genellikle bir tarafında pozitif, diğer tarafında negatif yüklü bir kutuda yapılır.

Ve hepimizin temel fizikte öğrendiği gibi, yüklü bir molekülü böyle bir ortama yerleştirdiğinizde, negatif moleküller pozitif yüke doğru hareket eder ve bunun tersi de geçerlidir. Jeldeki, bu kutulardan birinde bulunan proteinlere baktığınızda, genellikle tüm proteini alırsınız ve proteinin tüm uzunluğuna tekrar bakarsınız ve ne kadar büyük olduğunu görürsünüz ve ne kadar büyükse, o kadar kısa göç eder. jel, böylece Küçük proteinler, göç ettikleri için jelin ucuna yerleştirilir.

En uzak ve en büyük zirvede kalır. DNA söz konusu olduğunda, DNA çok uzun bir moleküldür, bu nedenle çoğu durumda bir jel üzerinde bir hücreden tam bir DNA molekülü çalıştırmak istemezsiniz.

O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Jelin içine daha kısa göç eder, böylece küçük proteinler jelin altına yerleştirilir, çünkü en uzak mesafelerde göç ederler ve en büyüğü üstte kalır.

DNA söz konusu olduğunda, DNA çok uzun bir moleküldür, bu nedenle çoğu durumda bir jel üzerinde bir hücreden tam bir DNA molekülü çalıştırmak istemezsiniz. O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Jelin içine daha kısa göç eder, böylece küçük proteinler jelin altına yerleştirilir, çünkü en uzak mesafelerde göç ederler ve en büyüğü üstte kalır.

DNA söz konusu olduğunda, DNA çok uzun bir moleküldür, bu nedenle çoğu durumda bir jel üzerinde bir hücreden tam bir DNA molekülü çalıştırmak istemezsiniz.

O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Çünkü onlar en uzağa göç ettiler ve en büyüğü zirvede kalacak. DNA söz konusu olduğunda, DNA çok uzun bir moleküldür, bu nedenle çoğu durumda bir jel üzerinde bir hücreden tam bir DNA molekülü çalıştırmak istemezsiniz.

O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Çünkü onlar en uzağa göç ettiler ve en büyüğü zirvede kalacak. DNA söz konusu olduğunda, DNA çok uzun bir moleküldür, bu nedenle çoğu durumda bir jel üzerinde bir hücreden tam bir DNA molekülü çalıştırmak istemezsiniz.

O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Bir hücreden bir jele tam bir DNA molekülü. O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Bir hücreden bir jele tam bir DNA molekülü. O kadar büyük ki asla jele girmiyor, bu yüzden bilim adamlarının yaptığı ve bugün insanların sınıfta yaptığı şey, DNA’yı bir şekilde daha kontrol edilebilir parçalara dönüştürebilen yazıt enzimleri gibi şeyler kullanarak bu DNA’yı parçalamak. parçalar, ne kadar büyük olduğuna bağlı olarak, kutunun altından yukarıdan aşağıya baba jeline az ya da çok göç eder.

Elektroforez türleri

geleneksel elektroforez

Konvansiyonel elektroforez, proteinlerin ve nükleik asitlerin ayrılması için geleneksel ve en yaygın olarak kullanılan klinik laboratuvar yöntemidir. Bu teknik genellikle, bir jel üzerine birden fazla numune ve kontrol yerleştirebildiğinden ve bir çalışmada çözünenleri ayırmak için kullanılabildiğinden, “alan elektroforezi” olarak da adlandırılan dikdörtgen bir levha jel üzerinde gerçekleştirilir. BOS ve idrar proteinlerini, izoenzimleri, lipoproteinleri ve hemoglobini izole etmek için de kullanılabilir.

Yüksek çözünürlüklü elektroforez

Yüksek çözünürlüklü elektroforez (HRE), geleneksel yüksek voltajlı elektroforezden başka bir şey değildir. Açıkça daha yüksek proteine ​​ihtiyacınız varsa (örneğin, multipl skleroz teşhisi için BOS proteinlerinin izolasyonu, multipl miyelomun erken tespiti için idrarda hafif zincirlerin izolasyonu vb.) genellikle şiddetle tavsiye edilir.

 Voltajdaki artış üretilen ısıyı da arttırdığından, HRE, proteinlerin denatüre olmasını ve jelin ve diğer bileşenlerin kurumasını önlemek için bir soğutma cihazı içerir.  

Poliakrilamid (SAYFA)

Akrilamid elektroforezi (PAGE olarak da bilinir), moleküler boyut ve kütle-kütle oranına dayalı olarak proteinleri izole etmek için yaygın olarak kullanılır.

 Dikey çubuklar veya silindirlere gömülü dikey plakalar veya jeller yardımıyla, araştırmacılar 100 bp veya daha az DNA’yı izole edebilir ve tek bir proteini tek bir serumda (genetik varyantlar, izoenzimler gibi) analiz edebilir.

 Basitliği ve ayırma hızının yanı sıra, araştırmacılar PAGE’yi severler çünkü jeller geniş bir pH ve sıcaklık aralığında stabildir ve farklı gözenek boyutlarına sahip jeller oluşabilir.

Kapiler elektroforez (CE)

Kılcal elektroforez, çapı bir milimetreden küçük olan kılcal damarlarda (yani, 25 ila 100 mm iç çapa sahip çok ince, kaynaşmış silika kılcal borular) gerçekleştirilir ve analitin ayrılmasını kolaylaştırmak için yüksek performanslı sıvı elektroforezi ve kromatografiyi birleştirir.

 Pek çok araştırmacı CE kullanmayı tercih eder çünkü az miktarda numune gerektirir, çok verimlidir, hızlı sonuçlar verir ve kolayca otomatikleştirilebilir. 

İzoelektrik odak (IEF)

Amfoterik bileşikleri (proteinler gibi) daha net bir şekilde ayırmak istiyorsanız bu protokolü kullanmalısınız. IEF, jel yüzeyinde bir pH gradyanı oluşturmak için kimyasal olarak enjekte edilmiş jeller kullanır ve protein moleküllerinin net yüklerinin sıfır olduğu bir noktaya (izoelektrik nokta) geçişini kolaylaştırmak için çok yüksek bir voltaj uygular.

 IEF kullanmanın avantajlarından bazıları şunlardır: kullanım kolaylığı (yani, protein her zaman pl’sine uygun konumda olduğu için numunenin kullanılması önemli değildir) ve yüksek çözünürlüğüdür. 

İmmünfiksasyon elektroforezi (IFE)

Genel olarak, IFE, varlığı multipl miyelom veya Waldenstrom makroglobulinemisi gibi durumları gösterebilen IgA, IgG ve IgM gibi tek bir işlevsiz antikorun monoklonal immünoglobulin gammopatilerini veya monoklonal dilatasyonunu teşhis etmek için kullanılır. Protein antijenlerini ve bunların parçalanmış ürünlerini incelemek için de kullanılabilir.

Darbe alanı jel elektroforezi (PFGE)

50 kb (A kb) üzerindeki büyük DNA moleküllerini geleneksel elektroforez sistemlerinde AGE veya PAGE kullanarak ayıramazsınız çünkü jelin gözenek boyutu o kadar küçüktür ki onların göç etmesine izin vermez.

 Bununla birlikte, büyük DNA moleküllerinin (10 MB’a kadar) başarılı bir şekilde bölünmesini kolaylaştırmak için darbe alanı jel elektroforezi (PFGE) kullanabilirsiniz. 

PFGE, jel matrisine sürekli değişen bir elektrik akımı uygulayarak DNA parçalarını etkili bir şekilde ayırır.

 Elektroforez sırasında döngülerdeki pozitif ve negatif elektrotları değiştirerek, DNA molekülleri yön değiştirmeye ve sonunda daha küçük parçalara ayrılmaya zorlanır. 

PFGE, genotip veya genetik parmak izinde yaygın olarak kullanılır ve basitliği ve tekrarlanabilirliği nedeniyle bakteri alt grubunda altın standart olarak kabul edilir. 

Ancak, bu protokol çok zaman alıcıdır ve yüksek düzeyde beceri gerektirir. Ek olarak, fragmanlar boyutlarına göre ayrıldığından (yani segregasyon sekansla yapılmadığından) sonuçları yorumlamak zor olabilir ve aynı boyuttaki parçalar aynı kromozomdan gelmeyebilir.

İki boyutlu elektroforez

İki boyutlu elektroforezde, numune iki ayrı ayırma tekniği kullanılarak ayrılır (örn. IEF ardından PAGE veya AGE) ve dik açılarla iki boyutta tanımlanır.

 Ortaya çıkan bantlar ikinci elektroforez tarafından daha fazla çözüldüğünden, numunenizden daha fazla bilgi almanız daha olasıdır. 
İki boyutlu elektroforez oldukça uzmanlaşmıştır ve proteomik ve genetik araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Tek seferde binlerce proteini analiz edebilse de, teknik önemli miktarda prototip, sınırlı tekrarlanabilirlik ve düşük verim gerektirir. 

Ek olarak, bu yöntem yalnızca orta ila büyük biyomoleküllerle çalışır ve doğru ölçümler sağlamaz.

Jel ve DNA elektroforezi

• Elektroforez, farklı uzunluklardaki DNA parçalarını tespit etmenizi sağlar.
• DNA’nın negatif bir yükü vardır, bu nedenle jele bir elektrik akımı uygulandığında, DNA pozitif yüklü elektrota göç eder.
• Daha kısa DNA iplikleri, jeldeki uzun ipliklerden daha hızlı hareket eder, bu nedenle parçalar büyüklük sırasına göre düzenlenir.
• Boya, floresan  kullan  ^? Etiketler mi  radyoaktif  ^mi? Etiketler, ayırmadan sonra jel üzerindeki DNA’nın görülmesini sağlar. Jel üzerinde çizgiler olarak görünürler.
• Belirli uzunluklarda fragmanları olan bir DNA markörü genellikle jelden numunelerle aynı anda geçer.
• DNA numunelerinin bantlarını DNA işaretleyici şeritlerle karşılaştırarak numunelerdeki DNA parçalarının yaklaşık uzunluğunu belirleyebilirsiniz.

Elektroforez uygulaması

Jel nasıl hazırlanır

• Agaroz jeli  ^? Genellikle DNA parçalarını görselleştirmek için kullanılır. Jeli yapmak için kullanılan agaroz konsantrasyonu, üzerinde çalıştığınız DNA parçalarının boyutuna bağlıdır.
• Agaroz konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, matris o kadar yoğun olur ve bunun tersi de geçerlidir. Daha küçük DNA parçaları, daha yüksek agaroz konsantrasyonlarında ayrılırken, daha büyük moleküller daha düşük agaroz konsantrasyonları gerektirir.
• Jel yapmak için, agaroz tozu bir elektroforez tamponu ile karıştırılır ve tüm agaroz tozunu eritmek için yüksek sıcaklığa ısıtılır.
• Erimiş jel daha sonra bir jel döküm tepsisine dökülür ve numune kuyularını pipetlemek için bir uca bir “tarak” yerleştirilir.
• Jel soğuduğunda ve katılaştığında (şeffaf yerine opak hale gelir), tarak çıkarılır.
• Artık birçok kişi önceden hazırlanmış jeller kullanıyor.
• Jel daha sonra bir elektroforez tankına yerleştirilir ve elektroforez tamponu jel yüzeyini kaplamak için tanka dökülür. Tampon elektriği iletir. Kullanılan tampon tipi, numunedeki DNA parçalarının yaklaşık boyutuna bağlıdır.

Elektroforez için DNA’nın hazırlanması

• Elektroforezden önce, numunenin viskozitesini arttırmak için DNA numunesine bir boya eklenir, bu da numunenin kuyularda yüzmesini önler, böylece numunenin migrasyonu jel boyunca görülebilir.
• Birinci jel kuyusuna bir DNA markörü (DNA boyutu standardı veya merdiveni olarak da bilinir) yüklenir. Göstergedeki parçalar belirli bir uzunluğa sahiptir, bu nedenle numunelerdeki parçaların boyutunu yaklaşık olarak belirlemeye yardımcı olmak için kullanılabilirler.
• Hazırlanan DNA örnekleri daha sonra jelin kalan kuyularına pipetlenir.
• Bu yapıldıktan sonra elektroforez tankının üzerine kapak takılır ve jelin yönünün ve pozitif ve negatif elektrotların doğru olduğundan emin oluruz (DNA’nın jelden pozitif uca göç etmesini isteriz).

Parçaları sökün

• Negatif yüklü DNA’yı jel boyunca jelin pozitif tarafına taşımak için elektrik akımı açılır.
• Daha kısa DNA uzunlukları, daha uzun uzunluklardan daha hızlı hareket eder, bu nedenle bir akış çalıştırırken daha fazla hareket edin.
• DNA’nın jel içinde göç ettiği mesafe, renk tamponu geçişi izlenerek görsel olarak değerlendirilebilir.
• Elektrik akımı, DNA parçalarının jel içinde onları ayıracak kadar uzun süre hareket etmesini sağlayacak kadar parlak kalır, ancak jelin ucunu terk edecek kadar uzun sürmez.

wiki/Electrophoresis