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什么是电泳?

电泳是实验室常用的技术,可按大小分离带电分子,例如 DNA。

  • 带电粒子穿过凝胶,电流通过凝胶。
  • 通过凝胶施加电流,使凝胶的一端带正电荷,另一端带负电荷。
  • 带电粒子的运动称为迁移。分子向相反的方向移动。因此,带负电荷的分子被拉向正端(相反的分子被吸收了!)。
  • 凝胶由一种可渗透的基质组成,有点类似于筛子,当电流通过它时,分子可以通过它。
  • 较小的分子比凝胶迁移得更快,因此比较大的分子迁移得更慢,因此移动的距离更短。结果,颗粒按大小分开。
 

凝胶电泳技术

电泳是一种通用技术,它基本上使用生物分子的电流,无论它们通常是 DNA,也可以是蛋白质或 RNA,并将这些小块分解成更大或更小的片段。

用于不同的应用。通过将他们的 DNA 模式和电泳模式与数据库中的样本联系起来,从法医到识别可能参与犯罪的人的一切。

构建人类基因组的整个基础是毛细管电泳,它将 DNA 分离成较短的片段,然后在电泳凝胶上运行它们,从而照亮 As、C、Ts 和 Gs 模式。

它在蛋白质研究和后来的基因研究中也非常重要。因为当蛋白质或DNA发生突变时,它们往往会变得更长或更短,因此在凝胶电泳中看起来与平常不同,因此许多诊断测试仍然使用电泳进行,因此这是一种广泛使用的研究方法。

了解基因和蛋白质的功能很重要,但它们现在也进入了临床和法医诊断领域。电泳通常在一侧带正电荷,另一侧带负电荷的盒子中进行。

正如我们在基础物理学中所学到的,当你将带电粒子置于这样的环境中时,负粒子会向正电荷移动,反之亦然。当您查看凝胶中的蛋白质时,通常在其中一个盒子中取出整个蛋白质并再次查看蛋白质的整个长度,看看它有多大,它越大,凝胶通过的时间越短,这样小蛋白质在迁移时就被放在凝胶的末端。

最远和最大的留在山顶。就 DNA 而言,DNA 是一个非常长的分子,因此在大多数情况下,您不希望在单个凝胶上从单个细胞中运行整个 DNA 分子。

它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

它们迁移到凝胶的时间较短,因此小蛋白质位于凝胶底部,因为它们迁移的距离最远,而最大的蛋白质则留在顶部。

就 DNA 而言,DNA 是一个非常长的分子,因此在大多数情况下,您不希望在单个凝胶上从单个细胞中运行整个 DNA 分子。它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

它们迁移到凝胶的时间较短,因此小蛋白质位于凝胶底部,因为它们迁移的距离最远,而最大的蛋白质则留在顶部。

就 DNA 而言,DNA 是一个非常长的分子,因此在大多数情况下,您不希望在单个凝胶上从单个细胞中运行整个 DNA 分子。

它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

因为他们迁移到了最远的地方,最大的会留在巅峰。就 DNA 而言,DNA 是一个非常长的分子,因此在大多数情况下,您不希望在单个凝胶上从单个细胞中运行整个 DNA 分子。

它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

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它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

从细胞到凝胶的完整 DNA 分子。它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

从细胞到凝胶的完整 DNA 分子。它是如此之大,以至于它永远不会进入凝胶,所以科学家们所做的,以及今天人们在课堂上所做的,是用蚀刻酶之类的东西将 DNA 切碎,这些酶可以以重复的方式使 DNA 变成更可控的片段,然后取决于在大小上,或多或少从盒子底部从上到下迁移到父亲的果冻上。

电泳的种类

常规电泳

常规电泳是用于分离蛋白质和核酸的传统且应用最广泛的临床实验室方法。该技术通常在矩形凝胶板上进行,也称为“区域电泳”,因为它可以将多个样品和对照放置在单个凝胶上,并可用于在一个循环中分离溶质。还可用于分离脑脊液、尿蛋白、同工酶、脂蛋白和血红蛋白。

高精度电泳

高精度电泳(HRE)无非就是传统的高压电泳。如果需要更高的蛋白质(例如,分离脑脊液蛋白质用于诊断多发性硬化症,分离尿液中的轻链蛋白质用于早期检测多发性骨髓瘤等),通常强烈推荐。

 由于电压增加也会增加产生的热量,因此 HRE 采用了冷却装置来防止蛋白质变性以及凝胶和其他成分变干。  

聚丙烯酰胺 (PAGE)

丙烯酰胺电泳(也称为 PAGE)通常用于根据分子大小和质量质量比分离蛋白质。

 借助嵌入垂直杆或圆柱体中的垂直板或凝胶,研究人员可以分离 100 bp 或更短的 DNA,并分析单个血清中的单个蛋白质(例如遗传变异、同工酶)。

 除了其简单性和分离速度之外,研究人员还喜欢 PAGE,因为凝胶在很宽的 pH 值和温度范围内都很稳定,并且可以形成不同孔径的凝胶。

毛细管电泳 (CE)

毛细管电泳在直径小于 1 毫米的毛细管(即内径为 25 至 100 毫米的超薄硅胶毛细管)上进行,并结合了高效液相电泳和色谱法以促进分析物的分离。

 许多研究人员更喜欢使用 CE,因为它只需要少量样品、高效、快速产生结果并且易于自动化。 

光电聚焦(IEF)

如果您想更清楚地分离两性化合物(如蛋白质),您应该使用此协议。IEF 使用化学注入凝胶在凝胶表面产生 pH 梯度,并施加非常高的电压以促进蛋白质分子转变到其净电荷为零的点(等电点)。

 使用 IEF 的一些优点是:易于操作(即是否使用样品无关紧要,因为蛋白质始终根据其轮廓定位)和高精度。 

免疫固定电泳 (IFE)

一般而言,IFE 用于诊断单克隆免疫球蛋白病或单一功能失调抗体(如 IgA、IgG 和 IgM)的单克隆扩增,其存在可能表明多发性骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症等疾病。它还可用于研究蛋白质抗原及其灭活产物。

脉冲凝胶电泳 (PFGE)

在常规电泳系统中,您无法使用 AGE 或 PAGE 分离大于 50 kb (A kb) 的 DNA 分子,因为凝胶孔径太小而无法转移。

 但是,您可以使用脉冲凝胶电泳 (PFGE) 来促进大 DNA 分子(高达 10 Mb)的成功分割。 

PFGE 通过向凝胶基质施加不断变化的电流来有效分离 DNA 片段。

 通过在电泳期间更换循环中的正极和负极,DNA分子被迫改变方向,最终分解成更小的碎片。 

PFGE 通常用于基因型或遗传指纹识别,因其简单性和可重复性而被认为是细菌亚群的金标准。 

但是,该协议非常耗时,并且需要高水平的技能。此外,解释结果可能很困难,因为片段按其大小分开(即分离不按顺序),并且相同大小的片段可能不来自同一条染色体。

二维电极

在 2D 电泳中,使用两种单独的分离方法(例如 IEF,然后是 PAGE 或 AGE)分离样品,并以正交角度在二维中测定。

 由于产生的条带会被第二次电泳进一步降解,您更有可能从样品中获得更多信息。 
二维电泳是高度专业化的,常用于蛋白质组学和遗传学研究。虽然它可以一次分析数千种蛋白质,但该技术需要大量原型、有限的重现性和低通量。 

此外,该方法仅适用于中型到大型生物分子,不能提供准确的测量结果。

DNA和凝胶电泳

  • 电泳使您能够检测不同长度的 DNA 片段。
  • DNA 带有负电荷,因此当向凝胶施加电流时,DNA 会移动到带正电荷的电极上。
  • 较短的 DNA 链比凝胶中的较长链移动得更快,因此这些片段按大小顺序排列。
  • 使用油漆,  荧光  ? 标签或  放射性  ? 这些标签可以让您在分离后看到凝胶上的 DNA。它们在凝胶上显示为条纹。
  • 具有特定长度片段的 DNA 标签通常与样品同时通过凝胶。
  • 通过将 DNA 样本集与 DNA 标签条进行比较,您可以确定样本中 DNA 片段的大致长度。

电泳应用

如何制备凝胶

  • 琼脂糖凝胶  ? 通常用于可视化 DNA 片段。用于制作凝胶的琼脂糖浓度取决于您使用的 DNA 片段的大小。
  • 琼脂糖浓度越高,基质密度越高,反之亦然。较小的 DNA 片段在较高浓度的琼脂糖下分离,而较大的分子需要较低浓度的琼脂糖。
  • 为了制备凝胶,将琼脂糖粉末与溶液电泳混合并加热到高温以溶解所有的琼脂糖粉末。
  • 然后将熔化的凝胶倒入凝胶浇注托盘中,并在一端放置“梳子”以吸取样品孔。
  • 当凝胶冷却并硬化后(它现在是不透明的而不是透明的),移除梳子。
  • 现在很多人都在使用预制凝胶。
  • 然后将凝胶放入电泳槽中,将电泳缓冲液倒入槽中以覆盖凝胶表面。绝缘体导电。使用的缓冲液类型取决于样品中 DNA 片段的大致大小。

用于电泳的 DNA 制备

  • 在电泳之前,将染料添加到 DNA 样品中以增加样品的粘度,防止其漂浮在孔中,从而可以通过凝胶看到样品迁移。
  • 将 DNA 标签(也称为标准或 DNA 大小阶梯)加载到第一个凝胶孔中。指示器中的片段有一定的长度,因此可以用来帮助估计样本中片段的大小。
  • 然后将制备好的 DNA 样品抽取到凝胶的剩余孔中。
  • 一旦完成,将盖子放在电泳槽上,我们检查凝胶的方向以及正负电极是否正确(我们希望 DNA 从凝胶到正端)。

拆卸零件

  • 然后运行电流以将带负电的 DNA 通过凝胶移动到凝胶的正极侧。
  • 较短的 DNA 长度比较长的 DNA 移动得更快,因此当流量打开时移动得更多。
  • DNA 在凝胶中迁移的距离可以通过观察颜色缓冲液的透射来目测评估。
  • 电流保持足够亮以确保 DNA 片段在凝胶中移动到足以分离,但不足以离开凝胶末端。

الکتروفورز

منبع :wiki/Electrophoresis

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