ما هو الكهربائي؟

الرحلان الكهربائي هو أسلوب شائع الاستخدام في المختبر لفصل الجزيئات المشحونة مثل الحمض النووي حسب الحجم.

• تتحرك الجزيئات المشحونة عبر مادة هلامية يمر من خلالها تيار كهربائي.
• يتم تطبيق تيار كهربائي عبر الهلام بحيث يكون لأحد طرفي الهلام شحنة موجبة والطرف الآخر شحنة سالبة.
• تسمى حركة الجزيئات المشحونة الهجرة. تتحرك الجزيئات في اتجاهين متعاكسين. وهكذا يتم سحب جزيء سالب الشحنة باتجاه الطرف الموجب (يتم امتصاص الأضداد!).
• يتكون الجل من مصفوفة قابلة للاختراق تشبه إلى حد ما منخل يمكن للجزيئات أن تمر من خلاله عندما يمر تيار كهربائي عبرها.
• تهاجر الجزيئات الأصغر بشكل أسرع من المواد الهلامية ، وبالتالي تتحرك أكثر من الجزيئات الأكبر التي تهاجر ببطء أكبر وبالتالي تنتقل لمسافات أقصر. نتيجة لذلك ، يتم فصل الجزيئات حسب الحجم.

تقنية الرحلان الكهربائي للهلام

الرحلان الكهربائي هو أسلوب متعدد الاستخدامات يستخدم بشكل أساسي تيارًا كهربائيًا للجزيئات البيولوجية ، سواء كانت عادةً DNA ، أو يمكن أن تكون أيضًا بروتينات أو RNAs ، وتقوم بتقسيم هذه القطع إلى قطع أكبر أو أصغر.

تستخدم في تطبيقات مختلفة. كل شيء من الطب الشرعي إلى تحديد الأشخاص الذين قد يكونون متورطين في جريمة ، من خلال ربط نمط الحمض النووي الخاص بهم ، ونمط الرحلان الكهربائي ، بعينة في قاعدة بيانات.

الأساس الكامل الذي بُني عليه الجينوم البشري هو الرحلان الكهربي الشعري الذي يفصل الحمض النووي إلى أجزاء أقصر ثم يديرها على مواد هلامية الرحلان الكهربائي ، مما يسمح بأنماط As و C و Ts و Gs بالإضاءة.

كما أنها مهمة جدًا في أبحاث البروتين ثم أبحاث الطفرات الجينية. لأنه عندما تتحور البروتينات أو الحمض النووي ، فإنها غالبًا ما تصبح أطول أو أقصر ، وبالتالي تبدو مختلفة عن المعتاد في الرحلان الكهربائي للهلام ، لا يزال يتم إجراء العديد من الاختبارات التشخيصية باستخدام الرحلان الكهربي ، لذا فهذه طريقة بحث مستخدمة على نطاق واسع.

من المهم فهم وظيفة الجينات والبروتينات ، لكنها دخلت الآن أيضًا في مجال التشخيص السريري والطب الشرعي. عادةً ما يتم إجراء الرحلان الكهربي في صندوق به شحنة موجبة من جانب وشحنة سالبة من ناحية أخرى.

وكما تعلمنا جميعًا في الفيزياء الأساسية ، عندما تضع جزيءًا مشحونًا في بيئة كهذه ، تتحرك الجزيئات السالبة نحو الشحنة الموجبة ، والعكس صحيح. عندما تنظر إلى البروتينات الموجودة في الهلام ، في أحد هذه الصناديق ، عادة ما تأخذ البروتين بالكامل وتنظر إلى الطول الكامل للبروتين مرة أخرى لترى حجمه ، وكلما زاد حجمه ، كلما كان أقصر ينتقل إليه الجل ، بحيث يتم وضع البروتينات الصغيرة في نهاية الجل لأنها هاجرت.

الأبعد والأكبر يبقى في الذروة. في حالة الحمض النووي ، الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا ، لذلك في معظم الحالات لا تريد تشغيل جزيء DNA كامل من خلية واحدة على هلام واحد.

إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

يهاجر بشكل أقصر إلى الهلام ، بحيث يتم وضع البروتينات الصغيرة في الجزء السفلي من الهلام ، لأنها هاجرت في أبعد مسافات ويبقى أكبرها في الجزء العلوي.

في حالة الحمض النووي ، الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا ، لذلك في معظم الحالات لا تريد تشغيل جزيء DNA كامل من خلية واحدة على هلام واحد. إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

يهاجر بشكل أقصر إلى الهلام ، بحيث يتم وضع البروتينات الصغيرة في الجزء السفلي من الهلام ، لأنها هاجرت في أبعد مسافات ويبقى أكبرها في الجزء العلوي.

في حالة الحمض النووي ، الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا ، لذلك في معظم الحالات لا تريد تشغيل جزيء DNA كامل من خلية واحدة على هلام واحد.

إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

لأنهم هاجروا إلى الأبعد وسيبقى الأعظم في الذروة. في حالة الحمض النووي ، الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا ، لذلك في معظم الحالات لا تريد تشغيل جزيء DNA كامل من خلية واحدة على هلام واحد.

إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

لأنهم هاجروا إلى الأبعد وسيبقى الأعظم في الذروة. في حالة الحمض النووي ، الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا ، لذلك في معظم الحالات لا تريد تشغيل جزيء DNA كامل من خلية واحدة على هلام واحد.

إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

جزيء DNA كامل من خلية إلى مادة هلامية. إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

جزيء DNA كامل من خلية إلى مادة هلامية. إنها كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل أبدًا ، لذا فإن ما يفعله العلماء ، وما يفعله الناس في الفصل اليوم ، هو تمزيق الحمض النووي باستخدام أشياء مثل إنزيمات النقش التي يمكن أن تجعل الحمض النووي إلى أجزاء أكثر قابلية للتحكم بطريقة كرر ثم تلك اعتمادًا على حجم القطع ، تهاجر بشكل أو بآخر إلى هلام الأب من أسفل الصندوق من أعلى إلى أسفل.

أنواع الرحلان الكهربي

الرحلان الكهربي التقليدي

الرحلان الكهربائي التقليدي هو الطريقة المخبرية السريرية التقليدية والأكثر استخدامًا لفصل البروتينات والأحماض النووية. عادة ما يتم تنفيذ هذه التقنية على لوح جل مستطيل ، يسمى أيضًا “الرحلان الكهربي للمنطقة” لأنه يمكن أن يضع عدة عينات وعناصر تحكم على هلام واحد ويمكن استخدامه لفصل المواد المذابة في دورة واحدة. ويمكن استخدامه أيضًا لعزل السائل الدماغي النخاعي وبروتينات البول والإنزيمات المتماثلة والبروتينات الدهنية والهيموجلوبين.

الرحلان الكهربائي عالي الدقة

الرحلان الكهربي عالي الدقة (HRE) ليس أكثر من رحلان كهربائي تقليدي عالي الجهد. عادة ما يوصى به بشدة إذا كنت بحاجة إلى بروتين أعلى (على سبيل المثال ، عزل بروتينات السائل الدماغي الشوكي لتشخيص التصلب المتعدد ، وعزل السلاسل الخفيفة في البول للكشف المبكر عن الورم النقوي المتعدد ، وما إلى ذلك).

 نظرًا لأن الزيادة في الجهد تزيد أيضًا من الحرارة المتولدة ، فإن HRE يشتمل على جهاز تبريد لمنع البروتينات من تغيير طبيعتها والهلام والمكونات الأخرى من الجفاف.  

بولي أكريلاميد (PAGE)

يستخدم الرحلان الكهربي للأكريلاميد (المعروف أيضًا باسم PAGE) بشكل شائع لعزل البروتينات بناءً على الحجم الجزيئي ونسبة الكتلة إلى الكتلة.

 بمساعدة الألواح الرأسية أو المواد الهلامية المضمنة في قضبان أو أسطوانات عمودية ، يمكن للباحثين عزل الحمض النووي بمقدار 100 نقطة أساس أو أقل وتحليل البروتينات الفردية في مصل واحد (مثل المتغيرات الجينية ، والإنزيمات المتساوية).

 بصرف النظر عن بساطته وسرعة فصله ، يحب الباحثون PAGE لأن المواد الهلامية مستقرة على نطاق واسع من الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة ، ويمكن أن تتشكل المواد الهلامية ذات الأحجام المختلفة للمسام.

الرحلان الكهربائي الشعري (CE)

يتم إجراء التفريد الكهربي للشعيرات الدموية على الشعيرات الدموية التي يقل قطرها عن ملليمتر واحد (أي أنابيب شعيرية من السيليكا شديدة النحافة وقطر داخلي يتراوح من 25 إلى 100 مم) ويجمع بين الرحلان الكهربي السائل عالي الأداء والكروماتوغرافيا لتسهيل فصل المادة التحليلية.

 يفضل العديد من الباحثين استخدام CE لأنها لا تتطلب سوى كمية صغيرة من العينة ، وهي فعالة للغاية ، وتنتج نتائج سريعة ، ويمكن تشغيلها آليًا بسهولة. 

التركيز الكهروضوئي (IEF)

إذا كنت تريد فصل المركبات المذبذبة (مثل البروتينات) بشكل أكثر وضوحًا ، فيجب عليك استخدام هذا البروتوكول. يستخدم IEF المواد الهلامية المحقونة كيميائيًا لإنشاء تدرج الأس الهيدروجيني على سطح الهلام ويطبق جهدًا عاليًا جدًا لتسهيل انتقال جزيئات البروتين إلى نقطة يكون فيها صافي شحنتها صفرًا (نقطة متساوية الكهرباء).

 بعض مزايا استخدام IEF هي: سهولة التشغيل (أي لا يهم إذا تم استخدام العينة لأن البروتين يكون دائمًا في موضعه وفقًا لمخططه) ودقته العالية. 

الرحلان الكهربي للتثبيت المناعي (IFE)

بشكل عام ، يتم استخدام IFE لتشخيص اعتلالات الغلوبولين المناعي وحيدة النسيلة أو تمدد أحادي النسيلة لجسم مضاد واحد مختل وظيفي مثل IgA و IgG و IgM ، والتي قد يشير وجودها إلى حالات مثل المايلوما المتعددة أو والدنستروم macroglobulinemia. يمكن استخدامه أيضًا لدراسة مستضدات البروتين ومنتجاتها المعطلة.

الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE)

لا يمكنك فصل جزيئات الحمض النووي الكبيرة التي يزيد حجمها عن 50 كيلو بايت (A كيلو بايت) باستخدام AGE أو PAGE في أنظمة الفصل الكهربائي التقليدية ، حيث إن حجم مسام الهلام صغير جدًا بحيث لا يسمح لها بالانتقال.

 ومع ذلك ، يمكنك استخدام الفصل الكهربائي للهلام النبضي (PFGE) لتسهيل التقسيم الناجح لجزيئات الحمض النووي الكبيرة (حتى 10 ميجابايت). 

تفصل PFGE شظايا الحمض النووي بشكل فعال عن طريق تطبيق تيار كهربائي متغير باستمرار على مصفوفة الهلام.

 من خلال استبدال الأقطاب الموجبة والسالبة في الدورات أثناء الرحلان الكهربائي ، تضطر جزيئات الحمض النووي إلى تغيير الاتجاه ، وفي النهاية تنقسم إلى قطع أصغر. 

يستخدم PFGE بشكل شائع في التركيب الوراثي أو البصمات الجينية ويعتبر المعيار الذهبي في المجموعة الفرعية للبكتيريا بسبب بساطته وقابليته للتكاثر. 

ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول يستغرق وقتًا طويلاً للغاية ويتطلب مستوى عالٍ من المهارة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تفسير النتائج صعبًا لأن الأجزاء مفصولة حسب حجمها (أي أن الفصل ليس بالتسلسل) والقطع من نفس الحجم قد لا تأتي من نفس الكروموسوم.

ثنائي الأبعاد الكهربائي

في الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد ، يتم فصل العينة باستخدام طريقتين منفصلتين للفصل (على سبيل المثال IEF متبوعًا بـ PAGE أو AGE) ويتم تحديدها في بعدين مع زوايا متعامدة.

 نظرًا لأن النطاقات الناتجة تتحلل أكثر من خلال الرحلان الكهربي الثاني ، فمن المرجح أن تحصل على مزيد من المعلومات من عينتك. 
يعتبر الرحلان الكهربي ثنائي الأبعاد عالي التخصص ويستخدم بشكل شائع في أبحاث البروتينات وعلم الوراثة. بينما يمكنها تحليل آلاف البروتينات دفعة واحدة ، تتطلب هذه التقنية قدرًا كبيرًا من النموذج الأولي ، وقابلية استنساخ محدودة ، وإنتاجية منخفضة. 

بالإضافة إلى ذلك ، تعمل هذه الطريقة فقط مع الجزيئات الحيوية المتوسطة إلى الكبيرة ولا توفر قياسات دقيقة.

الرحلان الكهربائي للهلام والحمض النووي

• يمكّنك الرحلان الكهربائي من اكتشاف أجزاء من الحمض النووي بأطوال مختلفة.
• يحتوي الحمض النووي على شحنة سالبة ، لذلك عندما يتم تطبيق تيار كهربائي على الهلام ، ينتقل الحمض النووي إلى القطب الموجب الشحنة.
• تتحرك خيوط الحمض النووي الأقصر بشكل أسرع من الخيوط الأطول في الهلام ، لذلك يتم ترتيب القطع حسب الحجم.
• استخدام الطلاء ،  الفلورسنت  ^؟ العلامات أو  المشعة  ^؟ تُمكِّن الملصقات من رؤية الحمض النووي الموجود على الجل بعد الانفصال. تظهر على شكل خطوط على الجل.
• عادة ما تمر علامة الحمض النووي ذات الأجزاء ذات الأطوال المحددة عبر الهلام في نفس وقت العينات.
• بمقارنة مجموعات عينات الحمض النووي بشرائط علامة الحمض النووي ، يمكنك تحديد الطول التقريبي لشظايا الحمض النووي في العينات.

تطبيق الرحلان الكهربي

طريقة تحضير الجل

• هلام الاغاروز  ^؟ يشيع استخدامها لتصور شظايا الحمض النووي. يعتمد تركيز الاغاروز المستخدم في صنع الجل على حجم شظايا الحمض النووي التي تعمل بها.
• كلما زاد تركيز الاغاروز ، زادت كثافة المصفوفة والعكس صحيح. يتم فصل قطع أصغر من الحمض النووي بتركيزات أعلى من الاغاروز ، بينما تتطلب الجزيئات الأكبر تركيزات أقل من الاغاروز.
• لصنع مادة هلامية ، يتم خلط مسحوق الاغاروز مع محلول رحلان كهربي ويتم تسخينه إلى درجة حرارة عالية لإذابة كل مسحوق الاغاروز.
• ثم يُسكب الجل المنصهر في صينية صب الهلام ويوضع “مشط” في أحد طرفيه لمص آبار العينة.
• عندما يبرد الجل ويصلب (يصبح الآن معتمًا بدلاً من أن يكون شفافًا) ، تتم إزالة المشط.
• كثير من الناس يستخدمون الآن مواد هلامية مسبقة الصنع.
• ثم يتم وضع الهلام في خزان الرحلان الكهربائي ويتم سكب المخزن المؤقت للرحلان الكهربي في الخزان لتغطية سطح الهلام. العازلة توصل الكهرباء. يعتمد نوع المخزن المؤقت المستخدم على الحجم التقريبي لشظايا الحمض النووي في العينة.

تحضير الحمض النووي للرحلان الكهربائي

• قبل الرحلان الكهربائي ، يتم إضافة صبغة إلى عينة الحمض النووي لزيادة لزوجة العينة ، مما يمنعها من الطفو في الآبار ، بحيث يمكن رؤية هجرة العينة من خلال الهلام.
• يتم تحميل علامة الحمض النووي (المعروفة أيضًا بمعيار أو سلم حجم الحمض النووي) في أول بئر هلامي. الأجزاء الموجودة في المؤشر لها طول معين ، لذا يمكن استخدامها للمساعدة في تقريب حجم الأجزاء في العينات.
• ثم يتم سحب عينات الحمض النووي المحضرة في الآبار المتبقية من الجل.
• بمجرد الانتهاء من ذلك ، يتم وضع الغطاء على خزان الرحلان الكهربائي ونتأكد من صحة اتجاه الهلام والأقطاب الموجبة والسالبة (نريد أن ينتقل الحمض النووي من الجل إلى النهاية الإيجابية).

تفكيك الأجزاء

• يتم تشغيل التيار الكهربائي بعد ذلك لتحريك الحمض النووي سالب الشحنة عبر الهلام إلى الجانب الإيجابي للجيل.
• تتحرك الأطوال الأقصر للحمض النووي أسرع من الأطوال الأطول ، لذا تحرك أكثر عند تشغيل التدفق.
• يمكن تقييم المسافة التي هاجرها الحمض النووي في الهلام بصريًا من خلال مراقبة انتقال المخزن المؤقت للون.
• يظل التيار الكهربائي ساطعًا بدرجة كافية للتأكد من أن شظايا الحمض النووي تتحرك بدرجة كافية في الهلام لفصلها ، ولكن ليس بالقدر الكافي لترك نهاية الجل.

منبع :wiki/Electrophoresis